01-тақырып Цитология · зертханалық 3D виртуалды жұмыс
Микроскопиялық зерттеулер

Көзге көрінбейтінді көру

Микроскоп құрылысы, ажырату қабілеті, препарат дайындау және қазіргі микроскопия әдістері

🔬 Жарық және электрондық🧪 Гистотехника📱 3 QR-тапсырма
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
02 Сабақ құрылымы

Оқу нәтижелері және жоспар

🎯 Мақсаты

Микроскоптың құрылысы мен оптикалық принциптерін меңгеріп, жасушаны зерттеудің жарық, электрондық және флуоресценттік әдістерін салыстыру, препарат дайындау кезеңдерін негіздеу.

Сабақ соңында студент:

  • жарық микроскобының механикалық, оптикалық және жарықтандыру бөліктерін атап, қызметін түсіндіреді;
  • үлкейту мен ажырату қабілетін есептеп, Аббе формуласын қолданады;
  • ТЭМ, СЭМ, флуоресценттік және конфокальды микроскопияны салыстырады;
  • гистологиялық препарат дайындау кезеңдерін ретімен сипаттайды;
  • зерттеу міндетіне сай әдісті таңдап, негіздейді.

⏱ Жоспар · 80 минут

5′Мотивация: проблемалық сұрақ
10′Алдыңғы білімді белсендіру
30′Жаңа тақырып: 3D модельдермен түсіндіру
10′3D-препарат: тақтада тану
15′QR-зертхана: 3 тапсырма
10′Кейс · бағалау · рефлексия
Проблемалық сұрақНеге ×2000-нан артық үлкейткенде жарық микроскобы жаңа ештеңе көрсетпейді — «бос үлкейту» деген не?
3D-визуализацияКейс-стадиФормативті бағалау
03 Негізгі ұғымдар

Терминдер мен анықтамалар

ЦитологияЖасушаның құрылысын, химиялық құрамын, тіршілік әрекетін, көбеюін, дамуын және өзара әрекеттесуін зерттейтін биология ғылымы (гр. kytos — жасуша, logos — ілім).
ГистологияКөп жасушалы организмдердің ұлпаларының құрылысын, дамуын және қызметін зерттейтін ғылым; цитология оның іргетасы.
МикроскопияКөзге көрінбейтін ұсақ объектілерді (жасуша, органоид, молекула) оптикалық немесе электрондық жүйелер арқылы үлкейтіп зерттеу әдістерінің жиынтығы.
ҮлкейтуОбъектінің кескіні мен нақты өлшемінің қатынасы; жарық микроскобында окуляр мен объектив үлкейтулерінің көбейтіндісіне тең. Пайдалы үлкейту ≈ 500–1000·NA.
Ажырату қабілетіЕкі нүкте бір-бірінен бөлек көрінетін ең кіші арақашықтық (d). Неғұрлым d кіші болса, микроскоп соғұрлым ұсақ бөлшекті көрсетеді.
Сандық апертура (NA)Объективтің жарық жинау қабілетін сипаттайтын шама: NA = n·sinα (n — орта сыну көрсеткіші, α — объективке түсетін жарық конусының жарты бұрышы).
ИммерсияОбъектив пен препарат арасын сыну көрсеткіші шыныға жақын сұйықпен (кедр майы n = 1,515) толтыру; жарық шашырамай, NA мен ажырату артады.
ПрепаратМикроскоппен зерттеуге арнайы дайындалған объект: уақытша (тірі жасуша, су тамшысы) немесе тұрақты (фиксацияланған, боялған, бальзамға жабылған кесінді).
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
04 Негізгі ұғымдар

Анықтамалар · жалғасы

ФиксацияЖасуша құрылымын тірі кездегідей «тоқтатып» сақтау: белоктарды тұрақтандырып, ферменттік өздігінен қорытылуды (аутолиз) және шіруді тоқтату.
ГистохимияЖасуша мен ұлпадағы химиялық заттарды (ДНҚ, гликоген, липид, фермент) олардың орнын сақтай отырып, түрлі-түсті реакциялар арқылы анықтау әдісі.
АртефактПрепарат дайындау кезінде пайда болған, тірі жасушада болмайтын жасанды құрылым немесе өзгеріс (жиырылу, бос қуыстар, бояу шөгіндісі).
МорфометрияЖасуша мен органоидтардың өлшемін, ауданын, көлемін, санын сандық тұрғыда өлшеу әдісі; окуляр-микрометр, бейне-талдау бағдарламалары қолданылады.
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
05 Зерттелу тарихы

Ашылу тарихы

1590З. және Г. Янсендер (Голландия) — алғашқы құрама микроскоп (екі линза түтікте)
1665Р. Гук «Micrographia»: тоз қыртысынан «ұяшықтарды» көріп, cell (жасуша) терминін енгізді
1674А. ван Левенгук ×270 линзамен бактерияларды, қызыл қан түйіршіктерін, сперматозоидтарды сипаттады
1831Р. Броун — өсімдік жасушасынан ядро ашты
1838–39М. Шлейден мен Т. Шванн — жасуша теориясы; 1855 Р. Вирхов: «Omnis cellula e cellula»
1873Э. Аббе — ажырату қабілетінің дифракциялық шегін есептеді; иммерсиялық объективтер
1931–1938Э. Руска, М. Кнолль — электрондық микроскоп (Нобель 1986); 1965 — бірінші сериялық СЭМ
2014Э. Бетциг, Ш. Хелл, У. Мёрнер — суперажыратымды флуоресценттік микроскопия (Нобель)

Жасуша теориясының қазіргі қағидалары

  • Жасуша — тірі ағзаның құрылымдық, қызметтік және даму бірлігі
  • Жасушалар тек бөліну арқылы пайда болады
  • Барлық жасушалардың құрылысы мен химиялық құрамы ұқсас (бірегейлік)
  • Көп жасушалы ағзаның жасушалары ұлпаларға, мүшелерге бірігеді
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
06 Жарық микроскобы

Микроскоптың құрылысы

Механикалық бөлігі

  • Штатив (табан + иін), тубус, револьвер
  • Зат үстелі, препарат қысқыштары
  • Макро- және микрометрлік бұрандалар

Оптикалық бөлігі

  • Окуляр ×7, ×10, ×15
  • Объективтер ×8, ×40, ×90 (иммерсиялық)
  • Жалпы үлкейту = окуляр × объектив

Жарықтандыру бөлігі

  • Жарық көзі / айна
  • Конденсор және ирис-диафрагма — жарық ағынын реттейді
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
07 Оптика заңдары

Ажырату қабілеті

d = 0,61·λ / NA  ·  λ = 550 нм, NA = 1,4 → d ≈ 0,24 мкм

Негізгі ұғымдар

  • Ажырату қабілеті (d) — екі нүкте бөлек көрінетін ең аз арақашықтық
  • Сандық апертура (NA) = n·sinα; иммерсиялық майда n = 1,51
  • Адам көзі ≈ 0,1–0,2 мм; жарық микроскобы ≈ 0,2 мкм; ТЭМ ≈ 0,1–0,2 нм
  • Бос үлкейту: NA×1000-нан артық үлкейту жаңа деталь бермейді
ИммерсияОбъектив пен жабын шыны арасына кедр майы тамызылады — жарық сынбай, NA артады
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
08 Әдістер

Микроскопия түрлері

Жарық (жарық өрісі)Боялған препараттар; ×40–×1500
Фазалы-контрастыБоялмаған тірі жасушалар; фаза айырмасы → контраст
Қараңғы өрісШашыраған жарық; ұсақ бөлшектер, бактериялар
ПоляризациялықАнизотропты құрылымдар: миофибрилла, крахмал
ФлуоресценттікФлуорохромдар, GFP, иммунофлуоресценция
Конфокальды лазерлікОптикалық қималар → 3D реконструкция
ТЭМУльтражұқа кесінді 50–100 нм; ішкі ультрақұрылым
СЭМБеттің 3D бейнесі; металмен бүрку
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
09 Гистотехника

Препарат дайындау

Тұрақты препарат кезеңдері

  • 1. Материал алу — биопсия, кесек 0,5–1 см
  • 2. Фиксация — 10% формалин: белоктарды тұрақтандырады
  • 3. Сусыздандыру — өсетін концентрациялы спирттер (70°→100°)
  • 4. Құю — парафин немесе целлоидин
  • 5. Кесу — микротом, 5–7 мкм (ТЭМ үшін ультрамикротом)
  • 6. Бояу — гематоксилин (ядро көк) + эозин (цитоплазма қызғылт)
  • 7. Жабу — канада бальзамы + жабын шыны
Уақытша препаратПияз қабықшасы: су тамшысы + йод ерітіндісі → ядро және крахмал көрінеді
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
10 Жұмыс тәртібі

Микроскоппен жұмыс ережесі

Реті

  • Жарықты ×8 объективпен реттеу (конденсор, диафрагма)
  • Препаратты қойып, макробұрандамен фокустау
  • Объектті ортаға келтіріп, ×40-қа ауыстыру
  • Тек микробұрандамен дәл фокустау
  • ×90: иммерсиялық май, объективті майға ақырын түсіру
  • Жұмыстан кейін объективті сүрту, ×8-ке қайтару

Өлшеу

Окуляр-микрометр объект-микрометр бойынша калибрленеді: бөлік құны = объект-микрометр бөліктері × 10 мкм / окуляр бөліктері.

🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
11 Электрондық микроскопия

ТЭМ және СЭМ

Трансмиссиялық электрондық микроскоп (ТЭМ)

Анықтамасы: жұқа (50–90 нм) кесінді арқылы өткен электрондар шоғы флуоресценттік экранда немесе камерада кескін түзетін микроскоп. Электронның толқын ұзындығы ≈ 0,005 нм, сондықтан ажырату қабілеті 0,1–0,2 нм-ге жетеді. Линзалардың орнында электромагниттік катушкалар; ішінде вакуум.

Сканерлеуші электрондық микроскоп (СЭМ)

Анықтамасы: алтынмен немесе көміртекпен бүркілген объектінің бетін жіңішке электрон шоғымен «сканерлеп», шағылған (екіншілік) электрондар арқылы көлемді, үш өлшемді бет бедерін беретін микроскоп. Ажырату 1–10 нм.

ПрепаратГлутаральдегид + OsO₄ фиксациясы, эпоксид шайырына құю, ультрамикротом
ШектеуіТірі жасушаны көру мүмкін емес; кескін қара-ақ; артефакт қаупі
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
12 Флуоресценция

Флуоресценттік және конфокалды микроскопия

Флуоресценттік микроскопия

Анықтамасы: қысқа толқынды (УК, көк) жарықпен қоздырылған флуорохромдардың ұзынырақ толқынды жарық шығаруына (Стокс ығысуы) негізделген әдіс. Боялған құрылым қара фонда жарқырайды.

  • Флуорохромдар: DAPI (ДНҚ — көк), FITC (жасыл), родамин (қызыл), GFP — медузаның жасыл флуоресцентті белогы (Нобель 2008)
  • Иммунофлуоресценция — антиденеге тіркелген бояу арқылы нақты белокты табу
  • Конфокалды лазерлік микроскоп — тесікше (pinhole) фокустан тыс жарықты кесіп тастайды; оптикалық кесінділерден 3D модель құрастырады
  • Суперажыратымды әдістер (STED, PALM, STORM) — 20–50 нм
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
13 Тірі жасушаны зерттеу

Прижизненді әдістер

Неге тірі жасуша маңызды?

Фиксация жасушаны «өлтіреді» — қозғалыс, бөліну, тасымал, циклоз көрінбейді. Тірі жасушаны зерттеу үшін бояусыз контраст беретін әдістер мен жасуша өсіру технологиясы қолданылады.

Фазалы-контрастыФ. Цернике (Нобель 1953): фаза айырмасын жарықтық айырмасына айналдырады
Дифференциалды интерференциялық (ДИК, Номарский)Бедерлі, «рельефті» кескін; қалың тірі объектілер
Прижизненді бояуНейтрал қызыл (вакуоль), Янус жасыл (митохондрия) — улылығы аз бояулар
Жасуша культурасыЖасушаларды қоректік ортада 37 °C, 5% CO₂ өсіру; HeLa — 1951 жылдан бергі «мәңгі» желі
Микрокиносъёмка (time-lapse)Митоз, миграция, фагоцитоздың уақытқа созылған бейнесі
МикрохирургияМикроманипулятор: ядроны ауыстыру, инъекция (ЭКҰ, ICSI)
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
14 Бояу әдістері

Гистологиялық бояулар және гистохимия

Базофилия және оксифилия

Базофилді құрылымдар (ядро, рибосомаға бай цитоплазма) қышқылдық топтары (фосфат) болғандықтан негіздік бояуды (гематоксилин — көк-күлгін) байланыстырады. Оксифилді (ацидофилді) құрылымдар (цитоплазма белоктары, коллаген) қышқыл бояуды (эозин — қызғылт) байланыстырады.

ӘдісНені анықтайдыТүсі
Гематоксилин–эозинЖалпы шолу: ядро / цитоплазмаКөк / қызғылт
Фёльген реакциясыДНҚҚызыл-күлгін
ШИК (PAS)Гликоген, гликопротеидтерТаңқурай қызыл
Судан III, IVЛипидтерҚызғылт сары
Браше (метил жасыл–пиронин)ДНҚ / РНҚЖасыл / қызыл
ИммуногистохимияНақты белок (антиген)Қоңыр (DAB)
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
15 Өлшеу және сандық талдау

Морфометрия және цитометрия

Өлшем бірліктері

1 мм= 1000 мкм
1 мкм= 1000 нм (жасуша, бактерия)
1 нм= 10 Å (мембрана ≈ 7–10 нм)
1 Å= 0,1 нм (атом аралығы)

Сандық әдістер

  • Окуляр-микрометр — объект-микрометр бойынша калибрленеді; бір бөлік құны = объект-микрометр бөлігі / окуляр бөліктері
  • Ағынды цитометрия — лазер сәулесінен өткен жасушаларды өлшемі, түйіршіктілігі, флуоресценциясы бойынша секундына мыңдап санау (иммунограмма, лейкоз)
  • Цитоспектрофотометрия — ядродағы ДНҚ мөлшерін өлшеу (плоидтілік)
  • Авторадиография — ³H-тимидин енгізіп, ДНҚ синтезі жүретін жасушаларды табу
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
16 Қорытынды

Тақырыптың негізгі түйіндері

  • Цитология — жасушаның құрылысын, қызметін және көбеюін зерттейтін ғылым, гистология мен медицинаның іргетасы.
  • Микроскоптың мүмкіндігін үлкейту емес, ажырату қабілеті анықтайды: d = 0,61·λ/NA; жарық микроскобы ≈ 0,2 мкм, ТЭМ ≈ 0,1–0,2 нм.
  • Иммерсиялық май сандық апертураны 1,4-ке дейін арттырып, ×90–100 объективпен жұмыс істеуге мүмкіндік береді.
  • Тұрақты препарат: материал алу → фиксация → сусыздандыру → құю → кесу → бояу → жабу.
  • Бояу базофилия/оксифилия принципіне негізделеді; гистохимия заттың орнын (ДНҚ, гликоген, липид) көрсетеді.
  • Тірі жасуша фазалы-контрасты, ДИК, флуоресценттік, конфокалды әдістермен және жасуша культурасында зерттеледі.
  • Электрондық микроскопия органоидтардың ультрақұрылымын ашты: ТЭМ — ішкі құрылым, СЭМ — беткі бедер.
  • Әр әдістің шектеуі бар — артефактілерді тану және әдістерді біріктіріп қолдану — зерттеушінің негізгі дағдысы.
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
17 Өзін-өзі тексеру

Сұрақ — жауап

1.Неге жарық микроскобында үлкейтуді ×3000-ға дейін арттыру пайдасыз?
👆 жауабын көру үшін бас
Ажырату қабілеті ≈ 0,2 мкм-мен шектелген (λ мен NA). Пайдалы үлкейтуден (≈ 1000·NA) асса, кескін үлкейеді, бірақ жаңа деталь көрінбейді — «бос үлкейту».
2.Окуляр ×15, объектив ×40. Жалпы үлкейту қанша?
👆 жауабын көру үшін бас
15 × 40 = ×600.
3.Иммерсиялық объективпен жұмыс істегенде майды неге қолданамыз?
👆 жауабын көру үшін бас
Шыны мен ауаның шекарасында жарық сынып, шашырайды. Май (n = 1,515 ≈ шыны) жарық конусын объективке толық жинап, NA мен ажыратуды арттырады.
4.Тірі амёбаның қозғалысын бояусыз көру үшін қай әдіс қолайлы?
👆 жауабын көру үшін бас
Фазалы-контрасты немесе ДИК (Номарский) микроскопия.
5.Гематоксилин–эозинмен боялғанда ядро неге көк түске боялады?
👆 жауабын көру үшін бас
Ядрода ДНҚ фосфат топтары қышқылдық қасиет береді → негіздік бояу гематоксилинді байланыстырады (базофилия).
6.Митохондрия кристаларын қай микроскоппен көруге болады және неге?
👆 жауабын көру үшін бас
Тек ТЭМ-мен: кристалар арасы ондаған нм, жарық микроскобының шегінен (200 нм) кіші; ТЭМ ажыратуы ≈ 0,2 нм.
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
18 3D-препарат · тақтада

Нөмірді ата, басып тексер

👆 Қалай ойнаймыз

  • Студент тақтаға шығып, нөмірді атайды және құрылымның қызметін айтады
  • Сары нөмірді басса — дұрыс жауап ашылады
  • Модельді айналдырып, барлық нөмірді тап

Талқылауға

  • Иммерсиялық объективпен жұмыс істегенде қай бұранданы ғана қолданамыз?
  • Конденсорды түсірсе кескін қалай өзгереді?
  • Жарық жолын жарық көзінен көзге дейін сипатта.
🖱 айналдыр · дөңгелек — жақындат
19 QR-зертхана · телефонмен

Үш виртуалды тапсырма

🔬 1 · 3D-препарат

3D модельде белгіленген құрылымды тап. 10 раунд.

20 балл

🧬 2 · Микроскоп шебері

Препарат кезеңдерінің реті, есептер, әдістерді сұрыптау

20 балл

🩺 3 · Кейс-тест

10 сұрақ: құрылыс → қызмет → патология. Жауаптар тексергеннен кейін ашылады.

20 балл

Кодсыз ашылады · аты-жөніңді жаз · соңғы экранның скриншотын жұмыс парағына тірке

20 Клиникалық / зерттеу кейсі

Білімді қолдан

Кейс 1 · Диагностика

Ісік биопсиясы алынды. Хирург 20 минутта жауап күтуде; кәдімгі парафин әдісі 1–2 тәулік алады.

Сұрақ: Қандай жедел әдіс қолданылады (криостат)? Оның кемшілігі қандай?

Кейс 2 · Зерттеу

Вирус бөлшектерінің (≈ 100 нм) жасушаға енуін көру керек, ал жарық микроскобы ештеңе көрсетпейді.

Сұрақ: Неге көрінбейді? Қай әдіс керек және препарат қалай дайындалады?

Кейс 3 · Артефакт

Препаратта жасушалар бүрісіп, арасында бос саңылаулар пайда болған. Сусыздандыру бірден 100° спиртпен жүргізілген.

Сұрақ: Артефакт неден пайда болды? Оны қалай болдырмауға болады?

Топпен талқылау 5 минут · жауапты жұмыс парағына жаз

21 Бағалау · Рефлексия

Не білдім, не үйрендім?

📊 Бағалау · 100 балл

Жұмыс түріБалл
QR-1 «3D-препарат»20
QR-2 «Микроскоп шебері»20
QR-3 «Кейс-тест»20
Жұмыс парағы30
3D-препарат, кейс талқылау10

90–100 «өте жақсы» · 75–89 «жақсы» · 50–74 «қанағаттанарлық»

🪞 Рефлексия «3–2–1»

  • 3 — бүгін түсінген ұғым
  • 2 — құрылыс пен қызмет байланысының мысалы
  • 1 — әлі де сұрағым келетін сұрақ

🏠 Өздік жұмыс (СӨЖ)

  • Өз препаратыңды дайында (пияз қабықшасы, ауыз қуысы эпителийі) және ×100, ×400 суретін сал
  • Келесі тақырып: Өсімдік және жануар жасушасы